1、急性毒性试验方法改良寇氏法K?rber法由K?rber于1931提出，后经Finney改进，顾汉颐作过改进，1963年孙瑞元教授对该法进一 步改进，改进后的计算方法称为点斜法或孙氏法，增加了不含0%和100%死亡率的校正式，所得LD50及全部有关参数与正规概率单位法相近。改良寇氏法（K?ber） 试验设计的原则是：各组剂量按等比级数；各组动物数相等：大致有一半组数 的动物死亡率在 10%- 50%之间，另一半在 50%100%之间，最好出现 0 %和100 %的剂量组。一、剂量选择及分组1、剂量选择剂量设计是否合理是急性毒性试验能否成功的关键。探求外源化学物的急性毒性，测定其LD50或LC5。

2、时，应首先广泛查阅文献资料，了解该化学物的化学结构和理化性质，如结构式、分子量、溶解度、挥发度、纯度及杂质含量等，其次确定测定LD5。的计算方法，然后设计剂量。2、预试验：总的原则是先用少量动物，以较大的剂量间距染毒，求出粗略的致死剂量范围，即确定受试动物全部 致死的最小剂量（b）和全部不致死白最大剂量（a）,即求出待测化学物 0 %100 %的大致致死剂量范围， 然后在这个剂量范围内按几何级数的间距设计57个剂量组，组间剂量呈等比级数 （r）,其比值为1.21.5。进行正式实验。用于急性毒性试验时，动物的体重为：大鼠180200g,小鼠1822g,豚鼠200250g,家兔22.5kg ,犬1

3、012 kg。用 于实验的同一批动物体重变异范围不得超过所用动物平均体重的 20%。仍然遵守雌雄各半或雌雄兼取的原则。当预试中发 现化学物的毒性有明显的性别差异时，则需要选用雌、雄两种性别的动物分别进行试验，求出各自的LD5。通过预试，找出受试化学物引起动物死亡的大致剂量范围，以此为依据设计正式试验的剂量和分组。按下式设计剂量组：r恐 a式中：r相邻两组剂量的比值，一般为1.21.5,b一最低全致死剂量量，a一最高不致死剂量， n设计的组数。分组恰当与否也是确保实验结果准确的条件之一。因为组数过多，需要消耗较多的动物，还可能出 现较大剂量组动物死亡率低于较小剂量组；组数过少，不能较精确求出LD

4、50。3、根据公比（r）计算各组剂量各组剂量分别为：第一组：a第二组：a r第三组：a r2第四组：a r3第五组：a r4第六组：a r5二、受试物溶液配制1、溶剂的选择毒理学试验中，常用的剂型有液体剂型、固体剂型。液体剂型中有溶液剂、混悬剂、乳化剂等。选择溶剂的原则是不与受试物发生化学反应，不改变化学物的毒性，故应根据受试物的理化性质，选择适当的 溶剂。一般而言，水溶性化学物可选择蒸储水或生理盐水，以水为溶剂，既经济、方便、易吸收，又无毒副作用。脂溶性化学物多选用植物油，如花生油、橄榄油。不溶于水而溶于油的化学物常用吐温-80或吐温-60配制成乳化剂。既不溶于水又不溶于油脂的化学物可选择淀

5、粉液、明胶液、竣甲基纤维素钠液（0.5-1%CMC等助悬剂配制成混悬液。 如用有机溶剂，实验动物应设溶剂对照组， 有机溶剂所用比例不宜超过 10% 溶解后，再用水稀释，必要时可加入增溶剂，如吐温 -80、聚乙二醇等，以提高溶液剂的浓度。2、配制方法受试化学物的配制方法有等浓度稀释法和等容量稀释法。等浓度稀释法|将受试物配制成一种浓度，不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积不同，剂量越高，所用的体积越大；剂量越低，所用的体积越小。比如某受试物的试验剂量分别为100、200、400和800mg/kg ,受试物配制成10 mg/ml ,每组动物每10g体重分另”给与 0.1、0.2、0.4和0.

6、8 ml。等容量3释法|将受试物配制成不同浓度， 不同剂量组实验动物单位体重所给受试物的体积相同，剂量越大，受试化学物配制的浓度越高。上例中，若实验动物按0.2ml/10g b.w 容量灌胃，则应配制成4个不同浓度，即 5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml 和 40mg/ml。灌胃体积依所选用的实验动物而定，一次灌胃的体积为：小鼠0.10.4ml/10g b.w,每只不超过1ml ；大鼠0.51ml/100g , 每只不超过4ml;家兔在5ml/kg之内;犬不超过50ml/kg ；为避免操作误差，等容量稀释的传统方法常采用1 ： K系列稀释法。该法操作简便、浓度精确、节约受试化学物。a

7、、确定各剂量组所需受试液浓度 如已知最高剂量组剂量为2000mg/kg b.w.,小鼠按等容量方法给予受试药液，即0.2ml/10g b.w.,相当于20ml/1000g b.w.,故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为 2000 mg/20ml,即10.0% （。）。b、确定每组所需受试液的量（m ml）按每只鼠体重25g计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.,则每组10只动物所需受 试液的量为5ml;c、确定母液总量配制时，根据实验设计要求确定最高剂量组所需受试化学物的浓度和总体积，配制母液。设母液浓度 为G,各组所需要的量为m ml,母液应配制的总量 M用下述

8、公式计算：式中，K为各组剂量的比值,1 KK=1/r 。d、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为 Cl的受试液，取 M ml作为母液，从母液中取出 m ml供最高剂量组染毒 用；然后取 m ml溶剂加入剩余的母液中，混匀，稀释后的母液浓度为C2 （Ci ： C2=1： k= r）,即次高剂量组所要求的浓度，从中取出 m ml供次高剂量组染毒用（第 2组），然后再加入 m ml溶剂，其稀释后的 浓度为C3 （C2 : C3=1.2）,取出m ml供第3组动物染毒用。依此类推，可配制成按 1 : K递减的各剂量组 不同浓度的试液。三、染毒各组小鼠分别按等容量方法给予相应浓度的受试药液，即0.2ml/1

9、0g b.w.。四、观察指标与试验期限急性中毒症状及出现时间，死亡数量、时间。大体剖检变化。试验期限为7-14天五、结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD50及其95%可信限1、试验结果列表表试验结果组别剂量（mg/kg）试验动物数死亡动物数死亡率（p）存活率（q）1102103104105102 计算LD50当急性毒性试验的最大剂量死亡率为100%,最小剂量的死亡率为0%;各组动物数相等；各剂量组的组距等比或剂量对数等差时，用下述基本公式计算LD50：1LD50 log 1Xm i（ p 0.5）当不含0%和100%死亡率时，用下式计算LD50：LD 50 log 1Xm i（ p 3 Pm

10、 Pn）4以上各式中：i一组距，即相邻两组剂量对数剂量之差X m最大剂量对数P各剂量组死亡率（死亡率均用小数表示）Pm一最高死亡率q各组剂量存活率，q=1-pPn 一最低死亡率mp一各剂量组死亡率之和n各组动物数Sx50 logLD 50的标准误LD 50 的 95 %可信限=log -1 （log LD 50 1.96 乂 Sx5o）改进K?rber法的优点是计算简便、结果精确，实用性大。我国新兽药一般毒性试验技术要求规 定用此法计算新兽药的LD50。举例：给小鼠口服某药进行急性毒性试验，测定 LD50。选择体重1824g健康小鼠（雌雄各半），按随机方法将动物分为 5个组，每组10只。经预试

11、找出死 亡率在0100%的剂量范围大约为 300600mg/kg b.w.。(1)预试(略)(2)计算公比r n1b,ar= 5-1600/300 =4 2 =1.189 =1.2?(3)根据公比（r）计算各组剂量第一组第二组第三组第四组第五组因而各组剂量分别为: a=300mg/kg b.w.1.2 2 = 432mg/kg b.w.1.2 3 = 518mg/kg b.w.1.2 4 = 622mg/kg b.w.a r =300 1.2 = 360mg/kg b.w.a r2 =300a r3 =300a r4 =300（4）受试液配制采用1: K系列稀释法配制不同浓度的受试液。（K=

12、1/r ）a、确定各剂量组所需受试液浓度：已知最高剂量组剂量为622mg/kg b.w.,小鼠按等容量方法给予受试药液，即 0.2ml/10g b.w.,相当于20ml/1000g b.w.,故最高剂量组所需受试液的浓度（母液浓度）为 622 mg/20ml ,即3.11% （G）；b、确定每组所需受试液的量按每只鼠体重25g计算（将损耗也计算在内），给药量为0.2ml/10g b.w.,则每组10只动物所需受 试液的量为5ml;c、确定母液总量各组动物需用本组浓度受试液的用量为5 ml （m）;各剂量组之比为0.833 （k=1/ r）,则母液应配制的总量为（ml）: =29.9999 =

13、30 (ml) 1 0.833d、配制母液选择适当的溶剂配制浓度为3.11% (Ci)的受试液，取30 ml作为母液，从母液中取出5ml供第五组(最高剂量组)接毒用，然后取5 ml溶剂加入25ml母液中混匀，稀释后的母?浓度为 2.59% (C2) (Ci ： C2=1 ： k=1.2),即第四组(次高剂量组)所要求的浓度，从中取出5 ml供第四组接毒用，然后再加入5 ml ( ml) 溶剂，其稀释后的浓度为 2.16% (C3) (C2 : C3=1.2),即第三组所需的浓度。依此类推，可配制第二组、 第一组所需浓度的受试液，分别为1.80%、1.50%(5)接毒各组小鼠分别按等容量方法给予

14、相应浓度的受试药液，即0.2ml/10g b.w.。(6)观察指标(7)结果及LD50的计算采用寇氏法计算LD50及其95%可信限a、将试验结果列入下表，按改良寇氏法进行计算；表试验结果组别剂量(mg/kg)试验动物数死亡动物数死亡率(p)存活率(q)130010001.023601020.20.834321050.50.545181070.70.3562210101.00b、按下列公式计算：1LD50 log 1Xm i( p 0.5)即：logLD 50=Xm d ( p 0.5)Xm=log622=2.7938i=log 1.2=0.0792p=0+0.2+0.5+0.7+1.0=2.4代入公式：logLD 50= 2.7938 0.0792 (2.4 0.5) =2.6433c 查反对数求出 LD 50=4